ПЦР диагностика

ПЦР диагностика (анализ)

Сущность метода ПЦР-диагностики

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) построен на принципах молекулярной биологии и относится к области генетических исследований.

Любой живой организм содержит в своей структуры молекулы нуклеиновых кислот – ДНК и РНК. Это своеобразный генетический паспорт, который помогает определить, к какому виду относится тот или иной его «предъявитель». Однако чтобы просканировать этот «паспорт», до недавнего времени требовался определенный минимальный объем биологического материала. Если концентрация ДНК была ниже необходимой, диагностический анализ был невозможен.

При диагностике методом ПЦР образец биологического материала обрабатывают специальными ферментами (полимеразами), которые позволяют запустить процесс многократного копирования имеющейся ДНК (РНК). Используя каскад цепной реакции, по принципу геометрической прогрессии всего за несколько часов можно из одной молекулы нуклеиновой кислоты получить несколько десятков триллионов копий. Такого объема более чем достаточно для проведения любых сравнительных исследований.

Для анализа используют амплификатор, в котором при соблюдении строгого температурного режима происходит процесс многократной репликации ДНК. Обычно достаточно 20-30 циклов репликации. Каждый их них включает 3 последовательных этапа:

  • денатурация — нагрев ДНК-матрицы до 96°C с разрушением водородных связей между соседними цепочками;
  • отжиг — понижение температуры на 4°C для создания репликативной вилки;
  • элонгация — запуск в работу ДНК-полимераз для синтеза новых нуклеотидных цепочек на основе материнской.

Каждый трехэтапный цикл длится в среднем 15-20 минут.

Преимущества ПЦР-диагностики

Анализ методом ПЦР высокотехнологичен и требует профессионализма от сотрудников лаборатории, но для современной медицины он стал источником беспрецедентных возможностей в области точной диагностики.

Преимущества ПЦР:

  • универсальность (исследованию можно подвергать любой биологический материал – от клеток крови, слюны и волос до подозрительных пятен на месте преступления);
  • высокий порог чувствительности (метод способен дать результат при наличии в образце единичных клеток или отдельных молекул ДНК);
  • многозадачность – за один подход можно выявить сразу несколько разновидовых носителей информации (бактериологические методы на такое не способны, так как требуют разных питательных сред для каждого вида микроорганизмов);
  • возможность проведения точного количественного анализа;
  • скорость обработки (в отличие от других видов генетических исследований, ПЦР-диагностика занимает всего 5-7 часов);
  • точность результата (при соблюдении технологии ошибка практически исключена);
  • относительно низкая стоимость (анализ ПЦР не выходит за рамки средней цены на стандартные тесты).

Все эти преимущества позволяют использовать полимеразную цепную реакцию для регулярного контроля за процессом лечения.

Разработчик метода ПЦР-диагностики не зря получил Нобелевскую премию за свое «детище». Метод полимеразной цепной реакции позволяет:

  • определить штамм инфекционного агента при минимальном содержании в биоматериале (вплоть до единичных вирусных структур);
  • вычислить точную концентрацию возбудителя во всем организме (для определения оптимальной дозы лекарственных препаратов);
  • оценить степень патологического воздействия на пациента и выявить штаммы с высокой фармакологической устойчивостью;
  • установить последовательные этапы заражения и сделать дальнейший прогноз.

Это интересно! Возможности ПЦР-анализа намного шире количественно-качественной оценки инфекционного фона в организме человека. Помимо выявления инфекций, его используют для установления родства, определения личности, выявления генетических патологий, сравнения биоматериала в криминалистике.

Какие инфекции позволяет выявить ПЦР диагностика

Анализ ПЦР способен с высокой точностью вычислить любой инфекционный носитель, внесенный в современный медицинский каталог заболеваний:

  • возбудителей гепатита всех видов (ПЦР позволяет выявить источник инфекции на стадии инкубационного периода и начать лечение задолго до проявления симптомов заболевания);
  • патогены ВИЧ и ЗППП (уреаплазмы, микоплазмы, хламидии, трихомонады);
  • группу TORCH-инфекций (актуально при обследовании беременных для раннего выявления патологий плода);
  • туберкулез (латентная форма заболевания);
  • кандидоз (латентная форма);
  • энтеровирусную инфекцию;
  • мононуклеоз;
  • листериоз;
  • сальмонеллез (определение конкретного штамма);
  • папилломовирус;
  • гарднереллез;
  • вирус клещевого энцефалита.

Особенно большой популярностью пользуется анализ на внутриклеточные инфекции (например, хламидии), определение которых обычным путем затруднено даже при высокой концентрации этих микроорганизмов в тканях пациента.

Учитывая многозадачность метода, можно сделать одновременный ПЦР-анализ на 12 базовых инфекций. Комплексный подход — удобный выбор для планового скрининга организма на предмет половых инфекций с минимальным риском ошибочного диагноза.

На заметку! С помощью ПЦР-диагностики делают прогноз по так называемым «спящим» формам инфекций, которые находятся в организме, не проявляя себя симптомами болезни (особенно важно при лечении гинекологических и урологических заболеваний, туберкулеза, клещевого энцефалита, папилломавируса).

Какие биологические материалы исследуются

Установленных норм и границ не существует. Универсальность метода позволяет использовать для анализа любой биологический материал:

  • мазок из влагалища, соскоб из уретры и цервикального канала (для диагностики ЗППП);
  • моча (туберкулез, некоторые ЗППП, цитомегаловирус);
  • кровь (ВИЧ, гепатит, TORCH-инфекции);
  • мазок из горла (мононуклеоз, цитомегаловирус);
  • ликвор (нейроинфекции)
  • амниотическая жидкость и ткани плаценты (анализ на TORCH-инфекции для предотвращения патологий развития плода);
  • плевральная жидкость (легочные инфекции).

Для иных видов ПЦР-диагностики (установление родства, сравнение биоматериала) используют слюну, волосы, ногти, эпителиальные клетки и другие источники генетической информации.

На заметку! Методом ПЦР-диагностики выявляют возбудителей не только в составе живых тканей, но и в образцах почвы, воды, растительных субстратов; оценивают патогенную активность микроорганизмов как в организме человека, так и в окружающей его среде (наличие установленного источника заболевания позволит предпринять соответствующие меры для его предотвращения в будущем).

Как подготовиться к сдаче анализа

Пациентам нашей клиники нет необходимости задаваться вопросом, где сдать анализ на ПЦР. Мы обеспечиваем все условия для стерильного забора материала и отправки его в лабораторию.

Специальная подготовка не требуется, но перечень общих рекомендаций соблюдать желательно. За несколько дней откажитесь от алкоголя, ограничьте курение, по возможности, исключите лекарственные препараты, постарайтесь избегать стрессовых ситуаций и тяжелых физических нагрузок.

В остальном подготовка к сдаче анализа зависит от вида биоматериала:

  • перед забором мазка или соскоба на урогенитальные инфекции воздерживайтесь от половых актов в течение 2-3 дней (женщинам следует проследить, чтобы день сдачи анализа не выпал на дни месячных);
  • перед тем как сдать анализ крови на ПЦР, воздержитесь от утреннего приема пищи (анализ сдается натощак) и выпейте стакан чистой негазированной воды;
  • перед сдачей мочи воздержитесь от продуктов, влияющих на кислотность мочи (фрукты, мясо, бобовые, зелень).

Важно! Самое главное требование в ПЦР-диагностике инфекций – чистота биоматериала. Поэтому постарайтесь приложить все усилия, чтобы исключить загрязнение тканей чужеродной ДНК (позаботьтесь о стерильности транспортировочного контейнера, личной гигиене, наличии чистой одежды).

Расшифровка анализа ПЦР

Результаты качественного ПЦР анализа на инфекции выдаются в виде таблицы, где напротив каждого инфекционного агента стоит соответствующая отметка:

  • отрицательный результат (возбудитель данного вида отсутствует);
  • положительный результат (возбудитель обнаружен).

Отсутствие симптомов заболевания может не соответствовать реальной картине, поэтому для кого-то результаты анализа будут неожиданными. Огорчаться не стоит: выявление инфекционного агента на ранних стадиях – ключ к успешному и быстрому излечению.

При проведении количественного анализа ПЦР можно оценить степень вирусной нагрузки (узнать количество копий вируса на единицу объема). Благодаря этому виду исследования можно определить интенсивность протекания инфекционного процесса, а также оценить эффективность лечения.

ПЦР анализ: цена и сроки

Среднее время проведения диагностики составляет 5-10 часов. Результаты в виде таблицы выдают уже на следующий рабочий день после забора биоматериала.

При выборе ПЦР-анализа цена не имеет кардинального значения. В среднем сумма затрат не выходит за рамки обычных биохимических тестов и, в отличие от основной массы генетических исследований, доступна всем пациентам.

Полимеразно-цепная реакция (ПЦР) – это одно из самых ярких достижений в сфере молекулярной биологии. Метод получил широчайшее распространение в разных областях науки. Благодаря очень высокой специфичности и чувствительности, метод ПЦР применяется в медицине, биологии, ветеринарии, криминалистике, санитарной службе и других отраслях деятельности человека.
Для анализа методом ПЦР можно использовать любые биологические материалы, которые содержат нуклеиновые кислоты (молекулу ДНК или РНК).

Принцип ПЦР- исследования

У каждого живого существа, по крайней мере, на нашей планете, есть уникальный «отпечаток» — ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота), которая отвечает за передачу наследственных факторов от предков к потомкам. Структурно эта молекула представляет собой две нити из молекул-азотитых оснований, удерживаемые рядом друг с другом химическими связями и скрученные в спираль (считается, что для компактности). Из курса биологии вы можете помнить такие названия, как аденин (А), гуанин (Г), тимидин (Т) и цитозин (ц). Это 4 нуклеотида, которые и создают последовательность ДНК. Вирусы хранят свою генетическую информацию в другой нуклеиновой кислоте – РНК.
Информация об уже изученных ДНК и РНК хранится в научных базах лабораторий. После того, как был изобретен метод ПЦР, для многих возбудителей различных заболеваний (бактерии, грибки и вирусы) были созданы свои специфические генетические детекторы (праймеры) — уникальные последовательности нуклеотидов, характерных только для конкретного возбудителя. И если поместить их в пробирку с исследуемым материалом, при наличии в нем ДНК или РНК «живых» возбудителей, праймеры запускают реакцию репликации – создания огромного числа копий, которое можно идентифицировать визуально. Т.е. они начинают копировать свою ДНК/РНК десятки раз.
И при подсчете результатов сотрудники лаборатории могут понять, есть ли искомые бактерии и вирусы в исследуемом образце, или нет, именно поэтому результаты ПЦР чаще всего качественные, т.е. «обнаружено» или «не обнаружено».

Кому мы обязаны появлением метода ПЦР?

Со слов американского биохимика Керри Мюллиса (Kary Mullis), идея идентифицировать живые организмы по короткому участку их генетического кода (ДНК) пришла ему в голову в 1983 году, по пути с работы домой. А в основе этой идеи, лежала работа другого американского биохимика, Артура Корнберга (Arthur Kornberg), которая в свое время не нашла отклика у научного сообщества.

Керри допустил возможность того, чтобы взять молекулу ДНК какого-либо организма, с помощью высокой температуры «распустить» ее спираль на две нити, специфическими маркерами-праймеры пометить уникальные для этого микроорганизма участки ДНК и затем, применив фермент ДНК-полимеразу, создать из двух нитей две новые молекулы ДНК. Но уже содержащие в себе меченные праймеры. И потом останется просто искать эти участки в диагностическом материале.

В итоге, корпорация CETUS, в которой работал Мюлис, выделила ему команду ученых. И в 1985 году, в издании Американского общества генетики человека, появилась публикация с теоретическим обоснованием ПЦР, как метода идентификации генетического материала живых организмов.

Как это все происходит в лаборатории

Выделение ДНК

Сначала пробу биологического материала подготавливают: центрифугируют, осаждают и т.д. Затем лаборантам необходимо выделить ДНК из полученного биологического концентрата.
Амплификация (увеличение числа копий ДНК)
Важнейший этап исследования. Проводится в термоциклере и именно здесь проходят все процессы, подпадающие под определение полимеразно-цепная реакция: денатурация, отжиг, элонгация.
Денатурация
Самый первый этап – развернуть (денатурировать) нуклеиновые кислоты, чтоб сделать их доступными для дальнейшей работы. Осуществляется путем нагрева реакционной смеси до 80-90 °C.
Отжиг
Денатурированные (распущенные) ДНК/РНК обрабатывают праймерами — изготовленными в лабораторных условиях коротенькими цепочками нуклеиновых кислот. Благодаря запрограммированному участку, праймеры прикрепляются только к тем нуклеиновым кислотам, для которых были созданы. Например, праймер для вируса простого герпеса 1 типа, никогда не свяжется с ДНК другого вируса, микроорганизма или клетки.
Именно праймеры обусловливают крайне высокую специфичность ПЦР – способность реагировать только на нуклеиновые молекулы конкретных типов, видов классов и даже штаммов микроорганизмов. Или отдельные виды клеток живых организмов.

Элонгация

Или синтез. После завершения процесса отжига, в реакционной смеси создают условия для активности полимеразы. Фермент, ориентируясь на молекулы праймеров (а не исходных нуклеиновых кислот), начинает синтез новых ниток ДНК/РНК. Которые становятся копиями исходных, искомых молекул нуклеиновых кислот.
Такой температурный цикл проводится 30 и более раз. В результате, даже при изначально небольшом количестве искомого генетического материала, в реакционной смеси накапливается значительное число «помеченных» праймерами нуклеиновых кислот (растет экспоненциально, с удвоением при каждом цикле).Обнаружить большие количества ДНК/РНК намного проще, за счет чего реализуется еще одно преимущество ПЦР – высочайшая чувствительность.

Детекция

Оценка результатов ПЦР проводится несколькими путями:

  1. Электрофорез в вязкой среде. Суть в том, что ДНК/РНК заряжены электрически и движутся к одному из электродов. В среду (агар или полиакридный гель) добавляют краситель ДНК (например – бромистый этидий). В процессе сеанса электрофореза, молекулы нуклеиновых кислот движутся и формируют скопления, подкрашенные этидием. Под ультрафиолетом, это выглядит в виде полосок разной толщины и яркости.
  2. Метод гибридизации. Используются праймеры, заранее помеченные люминофором (флуорофором). После нужного числа температурных циклов, применяют специальный прибор – детектор флюоресценции. За счет того, что в образец можно добавлять флуорофоры для разных мишеней (они будут и светиться под ультрафиолетом разным цветом), метод гибридизации подходит для диагностики сразу нескольких мишеней в одном образце.
  3. ПЦР диагностика в реальном времени (real-time PCR). Отличается тем, что детекция проводится прямо в процессе амплификации. Для этого нужны зонды-люминофоры (из предыдущего пункта) и специальные приборы ДНК-амплификаторы. Эти устройства оценивают нарастание яркости люминофора после каждого температурного цикла и впоследствии, вычисляют исходное число искомых нуклеиновых кислот в образце.

Электрофорез и гибридизация подходят только для качественной оценки, то есть дают ответ на вопрос, есть ли в образце искомый материал. ПЦР в реальном времени – единственный доступный метод количественной оценки.
Если мишеней для праймеров в образце не окажется, то температурные циклы пройдут в холостую и при детекции будет получен отрицательный результат.

Преимущества методики ПЦР

Всего разработано более 10 разных методик амплификации, применяемых лабораториями в зависимости от исходных условий и поставленных целей.
Общим для них есть высокая чувствительность (для положительного результата достаточно 40 (!) или менее искомых копий ДНК в 1 мл образца, то есть вероятность ложноотрицательного ответа ничтожно мала. И очень высокая специфичность: вероятность ложноположительного ответа составляет менее 1%.
Но точность результатов сильно зависит от качества сбора диагностического материала, тщательного соблюдения всех технических требований к каждому этапу и качеству оборудования, расходных материалов (буфера, праймеров, раствора для отмывки и т.д.).

Области применения в медицине

В дерматовенерологии ПЦР используют для выявления венерических заболеваний: микоплазменной, хламидийной инфекций, сифилиса, генитального герпеса и др.
Инфекционисты активно используют ПЦР для диагностики туберкулеза, ВИЧ, вирусных гепатитов, герпеса, мононуклеоза, вируса Эпштейн-Барр и др.). А с помощью ПЦР в реальном времени, оценивая вирусную нагрузку, врачи могут составить мнение о динамике заболевания, отклике на лечение, что особенно актуально для пациентов с ВИЧ, принимающих терапию.
Также благодаря ПЦР врачи могут в течение нескольких дней с уверенностью идентифицировать коклюш и паракоклюш, выявить возбудителей эпидемии ОРВИ. Уточняются типы вируса гриппа, циркулирующие на определенной территории, на основании чего появляется возможность разработать эффективную вакцину для каждого сезона гриппа.
В течение суток или быстрее можно установить вид возбудителя кишечной инфекции, а значит – назначить адекватное лечение и обнаружить вероятный источник заражения.
Летом, ПЦР актуальна для диагностики заболеваний, передаваемых иксодовыми клещами: боррелиоза (болезни Лайма), клещевых энцефалитов.
Метод позволяет работать с любым биологическим материалом. Гемотрансмиссивные инфекции (сифилис, ВИЧ, гепатиты, боррелиоз) исследуются по пробе венозной крови или спинномозговой жидкости. Кожные болезни (герпес, грибки) – по соскобу с пораженного участка. Венерические и урологические – по образцу мочи, спермы, влагалищного отделяемого.
Так что в медицине, ПЦР применяется везде, где нужна высокая точность и быстрота получения результатов.

Лабораторные исследования, выполняющиеся методом ПЦР:

пцр диагностика на Инфекции:

Полимеразная цепная реакция (ПЦР-диагностика)

Полимеразная цепная реакция (ПЦР-диагностика инфекций) основана на определении участков ДНК, специфичных для определенных патогенных микроорганизмов, в образцах биоматериала (соскобах эпителиальных клеток урогенитального тракта, крови или др.). Полимеразная цепная реакция является «золотым стандартом» диагностики большинства бактериальных, вирусных, грибковых инфекций. Тест обладает высокой специфичностью и чувствительностью, поскольку позволяет определять фрагменты ДНК, характерные для конкретного возбудителя, за счет их многократного копирования (амплификации) в лабораторных условиях. Обнаружение патогенов методом ПЦР возможно еще до возникновения симптомов инфекционного заболевания, т. е. на доклинической стадии, а также при латентном течении инфекции и в тех случаях, когда другие лабораторные методики (бактериологические, вирусологические, серологические) еще не дают положительного результата.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР), как метод лабораторной диагностики, был запатентован американским биохимиком Кэри Мюллисом в 1983 году, хотя параллельные исследования в этой области велись некоторыми другими американскими и советскими учеными. Однако именно К. Мюллис считается родоначальником метода ПЦР, за что спустя десятилетие был удостоен Нобелевской премии в области химии. Внедрение ПЦР в клиническую практику совершило настоящую революцию в диагностике инфекционных заболеваний, поскольку сделало возможным быстро (в течение 1-2 дней) выявлять даже самые малые концентрации патогенов, присутствующих в организме. Это позволяет диагностировать не только активные стадии заболеваний, но также их хроническое и скрытое течение. ПЦР исследования находят применение в диагностике вирусных гепатитов, ВИЧ, ЗППП, туберкулеза, респираторных, кишечных, трансмиссивных инфекций и мн. др. В настоящий момент анализы методом ПЦР проводятся повсеместно, во всех крупных лабораториях Москвы.

Сущность исследования

Полимеразная цепная реакция позволяет идентифицировать патогенные микроорганизмы путем выявления их генетического материала (РНК или ДНК) в биологических пробах, взятых от обследуемого человека. Это достигается путем многократного удвоения специфического фрагмента нуклеиновой кислоты патогена в присутствии фермента ДНК-полимеразы в лабораторных условиях. При этом копируется (амплифицируется) только строго определенный участок ДНК, специфичный для конкретного возбудителя, при его наличии в исследуемом материале. Весь лабораторный процесс проходит 3 этапа.

1. Выделение ДНК. Для очистки ДНК от посторонних примесей (белков, крови, слизи) пробу пропускают через сорбент, отмывают, центрифугируют, высушивают. Полученный осадок растворяют, получая очищенную ДНК в элюенте.

2. Амплификация. ПЦР-анализ проводят в амплификаторе – специальном приборе-термостате, который обеспечивает периодическое нагревание и охлаждение пробирок в циклическом режиме с точностью до 0,1°C. Обычно в ходе одного исследования выполняется 20-35 циклов, каждый из которых включает три фазы: денатурации ДНК, отжига и элонгации матричной цепи. На первом этапе пробирку с реакционным раствором, содержащим ДНК-матрицу, два праймера (короткие синтетические олигонуклеотиды, комплементарные концам искомого фрагмента), ДНК-полимеразу, дезоксинуклеотидтрифосфаты, ионы магния и буферный раствор, нагревают до 93-95°С на 30-40 сек. В результате нагрева происходит денатурация – расхождение цепей двухцепочечной ДНК-матрицы вследствие разрушения водородных связей между ними. Затем температуру смеси снижают до 50-65°С, что позволяет праймерам связаться с ДНК-матрицей. Эта фаза ПЦР (фаза отжига) длится не более 2-х минут. Для протекания третьей стадии – элонгации или достраивания матричной цепи – смесь вновь подогревают до 72°С (время третьей фазы зависит от длины амплифицируемого участка – в среднем 20-40 сек.). Таким образом, за два-три десятка циклов в пробирке накапливается множество копий фрагмента ДНК, достаточное для обнаружения, идентификации, качественной или количественной оценки возбудителя.

3. Электрофорез. Полученный субстрат, содержащий продукты амплификации, помещают в лунки с агарозным гелем. Анализатор подключают к источнику тока, проводя электрофорез. Под действием электрического тока фрагменты нуклеиновых кислот разделяются и затем становятся хорошо видимы в трансиллюминаторе в лучах ультрафиолета в виде светящихся полосок оранжевого цвета. В заключении получают изображение (электрофореграмму), которую анализируют на ПК.

Сегодня, наряду с вышеописанной методикой, широкое применение находит ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR). От стандартной ПЦР ее отличает добавление в реакционную смесь высокоспецифичных флуоресцентных меток, что позволяет измерять количество амплифицированной ДНК в настоящем времени сразу после завершения каждого цикла. Real-Time ПЦР предоставляет возможность проводить как качественный, так и количественный анализ, благодаря чему делаются выводы о стадии и динамике заболевания, эффективности этиотропной терапии. Также методика используется для генотипирования — определения штаммов вирусов (например, ВПЧ или гепатита В).

Сферы применения

Основные области применения ПЦР-диагностики включают:

  • инфекциологию — выявление возбудителей широкого круга воздушно-капельных, трансмиссивных и гемотрансмиссивных инфекционных заболеваний;
  • гинекологию, урологию и венерологию – выявление возбудителей урогенитальных инфекций;
  • онкологию и гематологию — детекция опухолевых клеток и генов, ассоциированных с онкологическими заболеваниями;
  • генетику — диагностика наследственных заболеваний, установление родства и отцовства;
  • эпидемиологию – выявление патогенов в пище;
  • экологию – мониторинг объектов окружающей среды (почвы, воды);
  • судебную медицину – идентификация личности и др.

В клинической медицине ПЦР-анализы чаще всего используются в диагностике различных инфекций (вирусных, бактериальных, паразитарных и др.). Спектр выявляемых вирусов чрезвычайно широк: это могут быть возбудители ВИЧ, гепатитов А, В, С, D, G; цитомегалии, инфекционного мононуклеоза, герпеса 1 и 2 типа, папилломавирусной инфекции (в т. ч. онкогенных типов ВПЧ), клещевого энцефалита и ряда других. В числе бактериальных агентов — хеликобактер пилори, возбудители туберкулеза, листериоза, кампилобактериоза, гарднереллеза, гонореи, сифилиса. Широко востребована ПЦР диагностика в выявлении внутриклеточных паразитов – хламидий, уреаплазм и микоплазм, которых сложно обнаружить другими лабораторными методами, а также инфекций, вызванных грибками и простейшими (кандидоз, трихомониаз).

Специфичность ПЦР в диагностике этих и других инфекций составляет 100%, что значительно превышает таковую у микробиологических, серологических, микроскопических методик. Бесспорным достоинством ПЦР-диагностики является возможность одновременно идентифицировать сразу несколько возбудителей в одной биопробе, поэтому многие лаборатории предлагают комплексные исследования — ПЦР-6, ПЦР-9, ПЦР-12, ПЦР-20 инфекций.

Правила взятия материала

Биологическими образцами, которые могут быть исследованы с помощью ПЦР, могут являться практически любые секреты организма — кровь, слюна, моча, сперма, кал, мокрота, отделяемое половых путей, спинномозговая, плевральная, суставная жидкость, а также эпителиальные соскобы и биоптаты. Однако точность результатов во многом зависит не только от неукоснительного соблюдения методики анализа, но и от правильности сбора и транспортировки исследуемого материала.

Забор любых биологических образцов для ПЦР-диагностики производится в условиях процедурного кабинета. Для этих целей используется исключительно стерильный (желательно, одноразовый) инструментарий и контейнеры. Для взятия крови применяются специальные вакуумные системы и одноразовые пробирки с антикоагулянтом. Соблюдение асептики и антисептики позволяет исключить контаминацию материала извне и, следовательно, получение недостоверных данных.

Существуют определенные требования при подготовке к анализу. Так, перед сдачей мазков и соскобов из урогенитального тракта необходимо за 3 суток до анализа исключить половые контакты, не подмываться антибактериальными средствами, не мочиться за 3 часа. У женщин биоматериал рекомендуется брать накануне менструации или через 1-2 дня после ее окончания, поскольку в эти периоды численность возбудителей инфекции максимально высока. Забор крови для ПЦР-диагностики должен производиться в утренние часы натощак. Если материалом для исследования служит моча, то собирается ее первая утренняя порция. Перед сдачей слюны полость рта требуется трехкратно прополоскать физиологическим раствором.

Взятую пробу необходимо как можно скорее доставить в диагностическую лабораторию (при невозможности незамедлительной транспортировки материал хранится в холодильнике при температуре от +4°С до +8°С). В отношении некоторых видов биоматериала допускается однократное замораживание и оттаивание. Контейнеры (пробирки) с пробами должны быть промаркированы и снабжены направлением на ПЦР-исследование, заполненным по установленной форме. Окончательный результат ПЦР анализа бывает готов уже в течение 1-2 суток (иногда буквально через несколько часов).

Результаты

Качественный результат ПЦР-обследования может быть положительным либо отрицательным. Положительный анализ указывает на выявление искомых инфекционных агентов в исследуемом материале; отрицательный – на их отсутствие. Получение ложноотрицательных результатов практически исключено; их минимальный процент может быть связан с латентной инфекцией или хронической инфекцией вне обострения. Ложноположительные реакции обычно обусловлены человеческим фактором (неправильным сбором, хранением и транспортировкой образцов, нарушением методики проведения ПЦР).

Количественная оценка (определение числа комплектов ДНК или РНК возбудителя в образцах материала, МЕ/мл) позволяет судить о так называемой вирусной/бактериальной нагрузке на организм, т. е. активности течения инфекционного процесса. Количественный анализ помогает подобрать дозу лекарственных препаратов и определиться с длительностью курса лечения. Через 1 месяц после завершения этиотропной терапии проводится контрольное ПЦР-исследование.

Сдать анализы методом ПЦР в Москве можно в специализированных лабораториях и лабораторных отделениях медицинских центров, оборудованных необходимой аппаратурой и тест-системами. Цена на ПЦР зависит от количества определяемых возбудителей, качественного или количественного тестирования, вида анализируемого материала.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *